چکیده

دیوزمتین فلاونید طبیعی بدست آمده از میوه‎های مرکبات و برخی گیاهان دارویی می‎باشد. مطالعات قبلی فعالیت ضدسرطان دیوزمتین را در برخی تومورها گزارش کرده‎اند. مشخص نیست که چگونه دیوزمتین تاثیرات ضدسرطان بویژه ضدآنژیوژنیک در سرطان پوست دارد. در این تحقیق از سلول‎های ملانوما B16F10 و سلول‎های اندوتلیای ورید ناف برای بررسی تاثیرات بازدارندگی دیوزمتین روی تکثیر سلولی، جابجایی و تشکیل مجرا استفاده کردیم. آزمایش‎های حلقه آئورت رت برای تعیین تاثیر دیوزمتین روی پشتیبانی ECS انجام گرفت. مدل ملانومای موش B16F10 برای مشاهده تاثیرات دیوزمتین روی رشد تومور، آنژیوژنیژ و متاستاز استفاده گردید. نتایج ما نشان دادند که دیوزمتین نه تنها تکثیر سلول تومور را سرکوب می‎کند بلکه آپویوژنیز سلولی را از طریق رشد مسیر کاسپاز در سلول‎های B16F10 القا کرده و از تشکیل مجرا و جابجایی سلولی در HUVEC جلوگیری می‎کند. آزمایش‎های حلقه آئورت موش نشان دادند که دیوزمتین جوانه‎زنی ECS را ضعیف می‎کند. مدل ملانومای موش نشان داد که دیوزمتین بطور قابل توجهی رشد تومور را از طریق بازدارندگی جوانه‎زنی و پیشرفت عروق توموری در پیش‎آگهی تومور را به تاخیر می‎اندازد. دیوزمتین نرمال‎سازی عروق تومور را از طریق کاهش تنظیم آنژیوپویتین-2 و بهبود پوشش پری‎سیت را القا کرده و باعث سرکوب تشکیل متاستاز در ریه و گره‎های لنفاوی می‎شود. در نتیجه نتایج ما نشان دادند که دیوزمتین از پیشرفت و متاستاز تومور با القای مرگ سلولی و بازدارندگی آنژیوژنیژ تومور و نرمال‎سازی عروق تومور دفاعی جلوگیری می‎کند که دیوزمتین را به عامل شیمی درمانی بالقوه تبدیل می‎نماید.

1- مقدمه

ملانومای بدخیم شکل مهلک سرطان پوست می‎باشد که تقریباً 90 درصد مرگ‎ها را در بردارد. در دهه‎های اخیر وقوع ملانوما افزایش یافته است. حدود 55000 مرگ در 2012 گزارش شد و براساس سازمان بین‎‎المللی عتبات سرطان در 2030 حدود 351396 مورد جدید 87725 مرگ مورد انتظار می‎باشد. تهاجمی بودن ملانوما با پتانسیل متاستازی بالا ارتباط دارد. اگر در مراحل اولیه تشخیص داده شود می‎توان از طریق جراحی آنرا از بین برد. در صورت متاستاز درمان آن دشوار خواهد بود.

شیمی درمانی گزینه درمانی انتخابی برای مدیریت ملانوما می‎باشد. در کل درمان‎های اخیر کارایی اندکی داشته و باعث تاثیرات منفی شده‎اند. توسعه داروی ضدسرطان موثر و ایمن ضروری است.

دیوزمتین بخش آگلیکون دیوزمتین گلیکوسید فلاونوید در مرکبات فراوانی یافت می‎شود و از گیاهان دارویی متعدد بدست می‎آید. فعالیت‎های درمانی دیوزمتین مثل خواص ضدباکتری، ضدالتهابی و آنتی‎اکسیدانی گزارش شده است. دیوزمتین تاثیر ضدتکثیری در برخی سلول‎های تومور مثل سلول‎های سرطان سینه MDA-MB468، سلول‎های سرطانی گردن رحم تزریق شده در موش‎ها و سلول‎های سرطانی هپاتوسلولی HepG2 دارد. فعالیت درمانی دیوزمتین در ملانومای بدخیم شناخته نشده است.

آنژیوژنیژ، تشکیل عروق جدید از طریق جوانه‎زنی در شرایط پاتولوژیکی مختلف اتفاق می‎افتد. در پیشرفت تومور آنژیوژنیژ القا شده تومور مواد مغذی و اکسیژن را تامین کرده و متابولیت‎ها را جدا می‎سازد که باعث رشد تومور می‎شود. عروق توموری یکی از مسیرهای انتشار سلول‎های توموری به اندام‎های دور است. بازدارندگی آنژیوژنیژ القایی تومور استراتژی برای درمان سرطان می‎باشد. عروق خون تومور بر ساختار و عملکرد تاثیر دارند. شبکه عروق تومور پروفوریون خون را به تومور به تاخیر انداخته و ریز محیط‎های اسیدی و هیپوکسی را ایجاد می‎کند که به افزایش مقاومت دارویی و انتشار به بافت‎های دور منجر می‎شود. از اینرو به نرمال‎سازی عروق تومور توجه شده است. فرایندی که می‎تواند عروق تومور معیوب را بازسازی کند. نرمال‎سازی شبکه عروق تومور ممکن است جریان خون تومور را افزایش دهد که باعث افزایش کارآیی شیمی درمانی می‎شود.

هدف ما بررسی چگونگی تاثیر ضدسرطان دیوزمتین در ملانوما بویژه روی آنژیوژنیژ می‎باشد. از سلول‎های B16F10، سلول‎های اندوتلیای ورید جفت و آئورت موش برای بررسی تاثیرات دیوزمتین استفاده کردم و تاثیر دیوزمتین را بر رشد تومور، عروق و متاستاز در مدل ملانومای موش تایید نمودیم.

2- مواد و روش‎ها

1-2- موش‎ها

تمام آزمایش‎ها روی حیوانات با تاییدیه کمیته مراقبت حیوانی دانشگاه چونبوک انجام شد. موش‎های C57BL-6 بدون پاتوژن ویژه از آزمایشگاه تهیه شدند و سپس با مشتقات لیبتوم برای دسترسی به رژیم استاندارد و آب تغذیه گردیدند.

2-2- مدل تومور و درمان دیوزمتین

سلول‎های ملانومای B16F10 از بانک سلولی کوه تهیه شدند. برای ایجاد مدل ملانومای کشت سوسپانسیون سلول‎های B16F10 به موش‎های هفت هفته‎ای تزریق شدند و موش‎ها به دو گروه بدون درمان و درمان شده با دیوزمتین تقسیم گردیدند. حجم تومور و میزان رشد تومور با استاندارد از روش‎های گزارش شده اندازه‎گیری شد. در موش‎ها با جابجایی سرویکال بافت‎ها برای آنالیز کشت داده شدند. دیوزمتین برای دو هفته از روز هفتم کشت تومور تزریق گردید. به عنوان گروه کنترل مقادیر مساوی PBS به همان روش تزریق شد.

3-2- آنالیز هیستولوژیکی

برای رنگامیزی هماتوکسلین و اتوزین (H&E) بافت‎های ریه در طول شبانه‎روز در پارافرمالدئید 4 درصد قرار داده شد. پس از عمل‎آوری بافت با استفاده از مراحل استاندارد نمونه‎ها در پارافین قرار داده شده و به مقاطع  در پی رنگامیزی H&E برش داده شد. برای تحقیقات ایمونوفلورسنت بافت‎های تومور و گره‎های لنفاوی (ILNS) در پارافرمالدئید 4 درصد به مدت چهار ساعت قرار داده شده در محلول ساکاروز 20% در طول شبانه‎روز دی‎هیدراته شده و در محیط یخ‎زدگی بافت قرار گرفتند. بلوک‎های یخ زده به قطعات  برش داده شدند. نمونه‎های برش داده شده با سرم 5% در 3/0% تریتون X-100 در سالین بافری فسفات (PBS) برای سه ساعت در درجه حرارت اتاق (RT) بلوکه شده و سپس در طول شبانه‎روز در 4 درجه سانتی‎گراد با آنتی‎بادی‎های اولیه زیر در حالت کمون قرار داده شدند: anti-CD31، اکتین ماهیچه‎ای آنتی آلفا با FITC ()، anti-LYVE-1، ant-caspase-3، آنتی پان سیتوکراتین و آنتی آنژیوپیوتین-2. پس چندین بار بیشتر نمونه‎ها برای دو ساعت در RT با آنتی‎بادی‎های ثانویه در حالت کمون قرار داده شدند: آنتی IgG همستر آمریکایی با Cy3 بزغاله، آنتی IgG خرگوش با Cys خر، آنتی IgG همستر آمریکایی با FITC بزغاله. هسته‎ها با 4’6 دیامیدینو-2-فنیلیندول رنگ‎آمیزی شدند. نمونه‎ها در محیط فلورسنت قرار داده شده و تصاویر ایمونوفلورسنت با استفاده از میکروسکوپ اسکن لیزری تهیه گردیدند.

4-2- آنالیزهای مورفومتریک

اندازه‎گیری چگالی عروق خونی و متاستاز با نرم‎افزار ImageJ انجام شد. برای چگالی یا تراکم عروق خون نواحی  اندازه‎گیری شدند. تعداد عروق خونی بیشتر از  در طیف  اندازه‎گیری گردیدند. برای تعیین میزان بیان Ang-2 ناحیه Ang-2+ در ناحیه تصادفی  در نواحی درون و خارج تومور محاسبه گردید. علاوه بر این، پوشش سلول‎های مورال  بصورت درصد طول مثبت فلورسنت مربوطه در راستای عروق CD31+ در نواحی تصادفی محاسبه شد. برای تعیین متاستاز گره‎های لنفاوی سیتوکراتین و ناحیه  در نواحی قشر و مدولا محاسبه شدند. برای آنالیزهای آپوپتوز caspase3+ در نواحی  در هر دو سلول‎های B16F10 و بافت‎های تومور اندازه‎گیری شد.

5-2- کشت سلولی و معرف‎ها

HUVECs و محیط رشد از گروه لونزا خریداری گردید. سلول‎ها در 5-4 مسیر در تمام آزمایش‎ها استفاده شدند. سلول‎های B16F10 در محیط Eagle’s با سرم گاوی، پنی‎سلین  و استرپتوسین  کشت شدند. تمام سلول‎ها در  با  5% در 4 حالت کمون قرار گرفتند. دیوزمین در دی متیل سولفوکسید برای بدست آوردن  یا  محلول حل شد که سپس با PBS اتوکلاو قبل از استفاده رقیق گردید.

6-2- آزمایش‎های تکثیر سلولی

تکثیر سلولی با آزمایش MTT تعیین شد. سلول‎های B16F10 در 24 ظرف در طول شبانه‎روز تست شده و با و بدون دیوزمتین آغشته شدند. پس از 24 ساعت محیط جدا شده و  طول MTT اضافه شد و ظروف برای دو ساعت در  در حالت کمون قرار گرفتند. پس با  دی متیل سولفوکسید جایگزین شده و برای 10 دقیقه تکان داده شدند.  نمونه به 96 میکروپلت انتقال داده شد. نتایج با اندازه‎گیری جاذب در  تعیین گردیدند.

7-2- آزمایش انتشار لاکتیت دی هیدروژیناز (LDH)

میزان LDH ترشح شده از سلول‎های آسیب دیده در محیط کشت با استفاده از کیست ردیاب سمی اندازه‎گیری شد. سلول‎های B16F10 در 24 ظرف قرار داده شد و با دیوزمتین برای 24 ساعت عمل‎آوری شد. محیط کشت در  برای ده دقیقه سانتریفاژ گردید. سوپرناتانت جمع‎آوری شده و در مخلوط واکنش LDH در RT برای سی دقیقه در تاریکی در حالت کمون قرار گرفت. میزان LDH آزاد شده در nm 490 تعیین شد.

8-2- آزمایش آناکسین V

آپوپتوز سلولی با آزمایش آناکسین V با استفاده از روش سیتومتری جریان ارزیابی شد. محتوای آناکسین V با اندازه‎گیری فلورسنس در nm488 و nm525 با استفاده از سیستم Guava easy تعیین گردید.

9-2- آزمایش جابجایی در شرایط آزمایشگاهی

سلول‎های B16F10 و HUVECs روی 6 ظرف یا صفحه رشد کردند. سلول‎های یک لایه‎ای با استفاده از نوک پیپت  خراش داده شده و با PBS شستشو شدند. محیط حاوی 21 سرم گاوی با غلظت‎های متفاوت دیوزمین اضافه گردید و تصاویر با استفاده از میکروسکوپ تهیه شدند.

10-2- آزمایش تشکیل مجرا در آزمایشگاه

برای آزمایش تشکیل مجرا عامل رشد در طول شبانه‎روز در  اعمال شد. به Matrigel اجازه سفت شدگی روی صفحه کشت را در  برای سی دقیقه داده شد. HUVECs در چگالی  سلول در محیط رشد با و بدون دیوزمتین کشت شد. سلول‎ها در  برای 18 ساعت دیگر در حالت کمون قرار گرفتند. تشکیل مجرا با تصویربرداری با میکروسکوپ مشاهده گردید. آزمایش با شمارش تعداد ریز مجراها از سه حوزه غلظت برای هر شرایط تعیین شدند.

11-2- آزمایش‎های حلقه آئورتی رت

برای مطالعه آنژیوژنیز آزمایش حلقه آئورت رت استفاده شد. آنورت توراپیک رت‎ها بصورت استریل جدا شده و در PBS یخی شستشو گردید سپس به قطعات به طول mm1 قطر جراحی تقسیم شدند. هر حلقه در صفحه ماتریس ژل قرار داده شد. محیط حاوی 10% سرم گاوی یا و بدون دیوزمین اضافه گردید. هفت روز بعد حلقه‎ها با میکروسکوپ آنالیز شدند.

12-2- وسترن بلاتینگ

در زمان مشخص نشده سلول‎های B16F10 در بافر لیز یعنی حاوی کوکتیل بازدارنده پروتئاز هموژنیزه شدند. هر پروتئین با SDS-PAGE تفکیک شده و به غشای نیتروسلولز انتقال داده شد. پس از بلوکه کردن با 5% شیر کم‎چرب غشاها با آنتی‎بادی‎های زیر در بافر در طول شبانه‎روز در  در حالت کمون قرار گرفتند. آنحتی کاسپاز 3- آنتی پولی ADP-ribose، پلیمراز (PARP) و  غشاهای آنتی‎بادی‎های ثانویه HRP برای یک ساعت در RT در حالت کمون قرار گرفتند. سیگنال‎های موجود با لایه HRP توسعه یافته و با سیستم FX7 ردیابی شدند.